IBS, 절단 유전체 시퀀싱 기법 활용
3세대 크리스퍼 유전자가위의 경우 가이드 RNA(Guide RNA)가 표적 DNA에 결합하면 절단효소 Cas9이 DNA 두 가닥 모두를 절단한다.
2016년에 학계에 보고된 시토신 탈아미노효소(cytidine deaminase)가 융합된 시토신 염기교정 유전자가위(위)는 DNA 서열 중 시토신(C)만 찾아 티민(T)으로 교체할 수 있다. 2017년 발표된 아데닌 염기교정 유전자가위(아래)는 아데닌 탈아미노효소(cytitdine deaminase)가 융합돼 서열 중 아데닌(A)만 찾아 구아닌(G)로 교체할 수 있다.
가이드 RNA가 표적 DNA에 결합하고 Cas9이 DNA의 한 가닥만 자르고 나면 그 사이에 탈아미노효소가 표적 DNA에서 아데닌(A)을 가수분해하고, DNA 복구 과정에서 이노신(I, 세포 내에서 시토신(C)과 결합)이 구아닌(G)으로 변형되는 원리다.
연구진은 아데닌 염기교정 유전자가위의 정확성을 측정하고자 절단 유전체 시퀀싱((Digenome-seq) 기법을 이용했다. 기존 절단 유전체 시퀀싱 기법은 DNA 두 가닥 절단이 유도돼야 했다.
아데닌 염기교정 가위의 경우는 한 가닥만 자르는 원리라 Endo V(Endonuclease V: 이노신 특이적 절단 시약) 효소를 사용했다. 아데닌 염기교정 가위가 DNA 한 가닥을 자르고 다른 가닥의 아데닌 (A)을 이노신 (I)으로 바꾸면, Endo V 효소가 잘리지 않은 가닥의 이노신 (I)을 절단해 DNA 두 가닥 절단 상태가 유지된다.
연구진은 이 방법을 활용해 절단 유전체 시퀀싱 기법을 진행한 뒤 전체 유전체 시퀀싱 기법(Whole genome sequencing)으로 아데닌 염기교정 가위의 정확성을 측정하는 데 성공했다.
변형된 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq) 기법을 활용해 아데닌 염기교정 유전자가위의 표적위치와 비표적위치를 찾은 이후 정확성을 높일 수 있는 방법들을 적용했다.
가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기가 추가된 아데닌 염기교정 유전자 가위, Sniper-아데닌 염기교정 유전자 가위를 기존 아데닌 염기교정 유전자 가위와 비교했다.
그 결과 가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기가 추가한 경우, Sniper 아데닌 염기교정 유전자 가위를 사용하였을 경우 그리고 Sniper 아데닌 염기교정 유전자 가위에 가이드 RNA의 말단에 구아닌 염기를 추가한 경우 모두 모두 정확성이 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
최신 유전자 교정기법인 염기교정 가위(Base Editor)를 한 단계 더 발전시킬 방법이 나왔다.
기초과학연구원(IBS, 원장 김두철) 유전체 교정 연구단은 DNA 염기 중 아데닌 염기만 바꾸는 ‘아데닌 염기교정 유전자가위(Adenine Base Editor, 이하 아데닌 염기교정 가위)’의 정확성을 규명하고, 이를 증대시킬 방법을 국제 학술지 네이처 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology)에 소개했다.
생명체에 관한 모든 정보를 담은 DNA는 네 개의 염기가 서로 쌍(아데닌(A)-티민(T), 시토신(C)-구아닌(G))을 이뤄 만든 서열로 구성돼 있다.
염기교정 가위는 단일 염기 하나만을 바꿀 수 있는 인공제한 효소로 2017년 학계에 보고된 아데닌 염기교정 가위는 아데닌(A)을 구아닌(G)으로 바꿀 수 있다.
염기교정 가위는 난치성 유전질환 연구와 치료에 진전을 가져올 도구로 주목받고 있다. 대부분의 유전질환이 단일 염기의 문제로 발생하기 때문에 발병 기전이나 치료법 개발에 큰 도움이 될 것으로 기대되나 유전자 교정기법으로 활용되려면 정확성 규명이 선행돼야만 한다. 표적 위치에서 정확하게 작동하는지, 의도치 않은 곳에서 오작동하지 않는지 확인하고, 정확성을 개선하는 연구가 뒷받침돼야 한다.
IBS 연구진은 인간 유전체 DNA에 유전자가위를 처리한 뒤 처리 전과 후를 비교하는 절단 유전체 시퀀싱(Digenome-seq) 기법을 변형해 정확성을 파악했다.
기존에는 DNA 두 가닥 절단이 유도돼야 했기에 이번 연구에서는 한 가닥만 자르는 염기교정 가위에서도 작동할 수 있도록 특정 효소(Endo V, 이노신 특이적 절단 시약)를 추가했다. 실험 결과 아데닌 염기교정 가위는 인간 유전체 32억 개 중 평균 60곳에만 변이를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.
더 나아가 연구진은 아데닌 염기교정 가위의 정확성을 높이는 방법을 다양하게 제시했다. 먼저, 교정할 염기를 찾아가는 가이드RNA 말단에 구아닌 염기를 추가해 길이를 조절하는 방식은 표적위치에서 작동 효율을 높이고 오작동할 확률을 낮출 수 있다고 소개했다. 정확성이 높다고 알려진 Sniper 유전자가위로 아데닌 염기교정 가위를 만들면 오작동 확률을 줄일 수 있다. 아데닌 염기교정 가위를 DNA(Plasmid DNA)에 싣지 않고 탈아미노효소와 가이드RNA를 혼합한 형태로 세포에 직접 전달하는 방식도 정확도를 향상시켜 표적위치만 자를 수 있음을 입증했다.
연구진은 “염기교정 가위의 정확성이 입증된 만큼 앞으로 이를 활용해 단일 염기 변이를 유도하거나 교정해야 하는 유전자 및 줄기세포 치료제 개발, 고부가가치 농축산물 품종 개량 등에 널리 활용될 것으로 기대된다”고 말했다.
이번 연구는 생명공학 분야 학술지 ‘네이처 바이오테크놀로지’(Nature Biotechnology, IF 35.724)에 3월 5일 새벽 1시(한국시간) 논문명 ‘Digenome-seq reveals genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors’, Daesik Kim, Da-eun Kim, Gyeorae Lee, Sung-Ik Cho, and Jin-Soo Kim 등으로 게재됐다.
IBS 유전체 교정 연구단은 2018년 4월 아데닌 염기교정 유전자가위로 동물의 특정 유전자 염기를 바꾸는데 성공해 같은 학술지에 연구성과를 게재한 바 있다. 2015년 자체 개발한 분석법(Digenome-seq)을 통해 3세대 유전자가위인 크리스퍼 Cas9과 크리스퍼 Cpf1은 물론 시토신(C)을 티민(T)으로 바꾸는 시토신 염기교정 가위의 정확성도 규명해 학계에 보고한 바 있다.